Protocolo de imunohistoquímica - Método Avidina/Biotina (ABC)
O princípio dos kits de detecção ABC baseia-se na afinidade da avidina (ou estreptavidina) pela biotina. De facto, a abreviatura ABC significa Avidin / Biotin Complex (complexo avidina/biotina).
Em geral, os kits de detecção ABC são compostos por:
- Um anticorpo secundário biotinilado
- Um complexo Avidina / Enzima
Os kits podem ou não conter os tampões de bloqueio e de diluição e o substrato, consoante os formatos.
I. Material necessário
Reagentes
- Um anticorpo primário , marcado ou não, contra a molécula alvo
- Kit de revelação
- Cromogénio
Amortecedores
- Xileno
- Banhos alcoólicos a 70%, 80% e 95%
- Peróxido de hidrogénio (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Intermédio-20
- Um anticorpo primário , marcado ou não, contra a molécula alvo
- Kit de revelação
- Cromogénio
Amortecedores
- Xileno
- Banhos alcoólicos a 70%, 80% e 95%
- Peróxido de hidrogénio (H2O2)
- Tris EDTA, Tris HCl
- Intermédio-20
II. Tempo de experimentação
- 10 min para bloqueio da peroxidase
- 30 minutos para recuperação de antigénio (se necessário)
- 30-60 min para incubação com anticorpo primário
- 10 min para incubação com anticorpo secundário biotinilado
- 10 min para incubação com conjugado de estreptvidina peroxidase
- 5 min para o cromogénio
- 5 min para o cromogénio
- Coloração com hematoxilina (opcional)
- TOTAL : 2-3 horas
- TOTAL : 2-3 horas
III. Protocolo
- Bloqueio da peroxidase: Aplicar 2 gotas (100 µl) ou um volume suficiente de reagente de bloqueio da peroxidase (solução de H2O2 a 3%) para cobrir a secção de tecido e incubar. Lavar a lâmina com água destilada.
-Pré-tratamento HIER (consultar a folha de especificações do anticorpo) : A recuperação de epítopos induzida pelo calor (HIER) pode ser necessária para o anticorpo primário sugerido pelo fornecedor. Lavar com PBS 2 min, 3 vezes.
- Pré-bloqueio: Adicionar 2 gotas ou um volume suficiente de solução de pré-bloqueio para cobrir completamente a secção de tecido e incubar. Remover a solução, não enxaguar.
- Anticorpo primário (fornecido pelo utilizador) : Aplicar 2 gotas ou um volume suficiente de anticorpo primário para cobrir completamente a secção de tecido. Incubar em câmara húmida durante 30-60 min.
- Anticorpo secundário: Aplicar 2 gotas ou um volume suficiente de anticorpo primário para cobrir completamente a secção de tecido. Incubar durante 10 minutos
- HRP-Streptavidina: Aplicar 2 gotas ou um volume suficiente de HRP-Streptavidina para cobrir completamente a secção de tecido e incubar durante 10 minutos. Lavar com PBS durante 2 minutos, 3 vezes.
- Cromogénio: Adicionar 1 gota ou 2 gotas (para maior sensibilidade e contraste) de concentrado de cromogénio a 1 ml de substrato. Misturar bem, proteger da luz e utilizar no prazo de 5 horas. Aplicar 2 gotas (100 µl) ou um volume suficiente de cromogénio pré-misturado para cobrir completamente o tecido e incubar durante 5 minutos. Lavar com água destilada durante 2 minutos, 3 vezes.
- Hematoxilina (opcional) : Colocar 2 gotas (100 µl) ou mais para cobrir completamente o tecido e aguardar cerca de 10-20 segundos. Enxaguar abundantemente com água da torneira durante 1-2 min. Colocar as lâminas em PBS até apresentarem uma cor azul (cerca de 30-60 segundos). Enxaguar bem em água destilada.
- Montagem: Siga o procedimento de montagem indicado na ficha de dados do fabricante.
Notas :
- A fixação, a espessura da lâmina de tecido, a recuperação de antigénio e a diluição primária e o tempo de incubação afectam significativamente os resultados. O investigador deve ter em conta todos os factores e determinar as condições ideais para interpretar o resultado.
- A coloração de tecidos depende do manuseamento e processamento adequados dos tecidos antes da coloração. Uma preparação incorrecta dos tecidos pode conduzir a resultados falsos negativos ou a resultados inconscientes.
- Não misturar reagentes de lotes diferentes.
- Não deixar secar as lâminas em nenhum momento durante a coloração.