Protocolo de revelação amplificado: DBS Gama

I. Material necessário

Reagentes
- Anticorpo primário
- Diluente de anticorpos primários
- Solução de pré-bloqueio
- Suporte de montagem

Buffers
- Tampão de lavagem imuno
- Xileno ou reagentes de desparafinagem
- Etanol absoluto
- Água destilada ou desionizada



II. Duração da experimentação

- 10 mn de bloq
- 30-60 minutos de incubação das secções no anticorpo primário
- 36 ou 31 milhões de outras incubações
- rinsing steps
- TOTAL : 1h31 a 2h06


III. Procedimento de coloração

1. Bloqueio da peroxidase. Incubar as lâminas no bloco de peroxidase durante 5 minutos.
Lavar as lâminas 3 x 1 minuto com Immuno Wash Buffer.
2. Pré-bloqueio (opcional). Adicionar 2 gotas (100 µL) ou volume suficiente de solução de pré-bloqueamento para cobrir a secção de tecido (10 minutos).
Escorrer ou eliminar a solução. Não enxaguar.
3. Anticorpo primário. Incubar com o anticorpo primário durante 30 a 60 minutos, preparado de acordo com o protocolo recomendado pelo fabricante na concentração pretendida. Os Anticorpos Primários concentrados podem ser diluídos utilizando o Diluente de Anticorpos Primários.
Lavar as lâminas 3 x 1 minuto com Immuno Wash Buffer.
4. Intensificador de penetração de polímeros. Aplicar o Intensificador de Penetração de Polímeros e incubar durante 10 minutos
Lavar as lâminas 3 x 1 minuto com Immuno Wash Buffer.

5. Etiqueta PolyVue. Incubar o tecido com o reagente PolyVue HRP Label durante 10 minutos
Lavar as lâminas 3 x 1 minuto com Immuno Wash Buffer.
6.DAB/Plus estável. Preparar a solução de trabalho de substrato DAB/Plus estável (ver acima).
Incubar o tecido durante 5-10 minutos com a solução de substrato Stable DAB/Plus preparada. Monitorizar o nível de coloração para determinar o tempo óptimo de incubação.
Lavar as lâminas 3 x 1 minuto com água.
7. Contra-indicação. Incubar o tecido durante 1 minuto com uma coloração de contraste (por exemplo, hematoxilina).
Lavar as lâminas 3 x 1 minuto em água, seguido de 1 x 1 minuto em Immuno Wash Buffer e depois 1 x 1 minuto em água.
8. Desidratação e cobertura. Desidratar os tecidos através de séries graduadas de etanol, seguidas de séries de xileno.
Aplicar lamelas com meio de montagem permanente.


IV.Motor de busca
- Anticorpo primário