Mesenchymal Stromal Cell-Derived Extracellular Vesicles for Reversing Hepatic Fibrosis in 3D Liver Spheroids

La pathogenèse de la fibrose hépatique est complexe et implique la libération de cytokines pro-inflammatoires, le recrutement de macrophages hépatiques et l'activation des cellules stellaires hépatiques (CSH) [1]. Les CSH jouent un rôle essentiel dans le développement de la fibrose hépatique, car elles subissent un changement phénotypique, passant de cellules inactives stockant la vitamine A à des myofibroblastes capables de proliférer et de produire des composants de la MEC [2]. Les CSH activées se caractérisent par l'expression de l'actine musculaire lisse alpha (α-SMA) et la synthèse de protéines de la MEC, notamment le collagène alpha 1 de type I (COL1A1), qui s'accumulent dans le foie et favorisent la progression de la fibrose [3,4].

Parmi les différentes maladies chroniques du foie, la fibrose hépatique constitue un problème de santé mondial important en raison de sa forte prévalence et de son impact substantiel sur le pronostic de la maladie et la qualité de vie [5,6]. En effet, la progression de la fibrose hépatique peut conduire à la cirrhose, qui cause environ 1 million de décès par an dans le monde [7]. En outre, environ 80 à 90 % des patients atteints de carcinome hépatocellulaire ont des antécédents de fibrose hépatique [8,9]. Le diagnostic et le traitement précoces de la fibrose hépatique sont des étapes cruciales pour atténuer le fardeau sanitaire mondial. Bien que de nombreux médicaments antifibrotiques aient été testés in vivo ces dernières années, aucun n'a été approuvé pour un usage clinique [10]. Cependant, de nouvelles approches prometteuses, telles que la médecine régénérative à base de cellules souches et la nanothérapie, sont apparues comme des traitements potentiels de la fibrose [11].

Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) sont des cellules semblables à des fibroblastes qui peuvent se différencier dans les sens ostéogénique, chondrogénique et adipogénique [12]. En outre, les CSM présentent des propriétés immunosuppressives, anti-inflammatoires et antifibrotiques [13]. Au cours des dernières décennies, des CSM ont été découvertes dans divers organes, y compris la moelle osseuse (CSM-MB) et le cordon ombilical (CSM-UC), et leurs effets bénéfiques ont été démontrés dans les cas de lésions pulmonaires, d'infarctus du myocarde, de diabète et de cirrhose du foie [14]. Malgré les nombreux avantages des CSM, leur administration peut présenter certains inconvénients. Par exemple, l'instabilité génétique in vitro et le risque de tumorigenèse peuvent limiter leur application clinique chez les patients [15].

Les CSM exercent principalement leurs effets thérapeutiques par le biais d'un mécanisme paracrine, en libérant diverses cytokines, des facteurs de croissance et des vésicules extracellulaires (VE) [13]. Le terme VE englobe un groupe diversifié de nanoparticules liées à la membrane, y compris les corps apoptotiques (1-5 µm de taille), les microvésicules ou ectosomes (100-1000 nm), et les exosomes (50-150 nm). En transférant des protéines, des lipides et diverses espèces d'ARN aux cellules réceptrices, les VE peuvent induire des changements épigénétiques dans les cellules tissulaires endommagées, favorisant ainsi leur régénération [16]. 

Au cours des dernières décennies, les VE dérivées des CSM (MSC-EV) ont montré un énorme potentiel thérapeutique pour diverses maladies chroniques, en particulier pour contrer la fibrose hépatique, principalement en réduisant l'inflammation et le dépôt de collagène [17,18]. Récemment, nous avons montré que les VE isolées à partir de cellules souches hépatiques humaines (HLSC), qui sont des cellules de type MSC résidant dans le foie, peuvent réduire l'expression de marqueurs spécifiques de la fibrose et influencer le paysage des lncRNA dans le foie de souris atteintes de stéatohépatite non alcoolique (NASH) [19,20]. En outre, dans un modèle in vitro de fibrose hépatique basé sur des CSH activées par le facteur de croissance transformant bêta 1 (TGF-β1) et cultivées en monocouche, nous avons démontré que les VE dérivées des CSH et des CSM-BM peuvent réduire efficacement l'expression de l'αSMA et de COL1A1 dans les CSH activées [21]. L'activité antifibrotique observée pourrait être attribuée aux différents composants transportés par les MSC-EV, en particulier à la présence de miARN spécifiques, tels que miR-146a-5p [21], miR-378c [22] et miR-199a-5p [23,24].

Un inconvénient important de la culture cellulaire traditionnelle en 2 dimensions (2D) est l'absence du microenvironnement environnant et des interactions entre les différents types de cellules hépatiques, ce qui rend difficile la reproduction exacte des mécanismes physiopathologiques de la fibrose hépatique [25]. Cependant, le développement récent de systèmes de culture en trois dimensions (3D) a permis d'étudier les interactions complexes entre les différentes cellules impliquées dans la progression de la fibrose, ainsi que les changements architecturaux et fonctionnels caractéristiques de la fibrose hépatique, tels que l'accumulation de protéines ECM induite par les CSH [26].  Des organoïdes et des sphéroïdes hépatiques de différentes compositions cellulaires ont été utilisés avec succès pour reproduire une variété de maladies hépatobiliaires in vitro afin d'étudier l'hépatotoxicité et de sélectionner des médicaments antifibrotiques [27].

Cette étude vise à développer différents modèles 3D de fibrose hépatique composés d'hépatocytes et de CSH. En utilisant ces modèles 3D, nous avons évalué le potentiel antifibrotique des VE isolées des BM-MSC et des UC-MSC cultivées dans des conditions chimiquement définies.

2. Matériels et méthodes :  

    2.1. Culture cellulaire :  

Les BM-MSC et UC-MSC humaines ont été fournies par RoosterBio (Frederick, MD, USA). Trois lots différents exempts de xéno de chaque source de cellules ont été utilisés. Après décongélation, les cellules ont été ensemencées à une concentration de 3000 cellules/cm2 dans des flacons de culture cellulaire T75 (Sarstedt, Milan, Italie), enduites de 0,1 mL/cm2 de 2,5 µg/mL de vitronectine (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Carlsbad, CA, USA) dans une solution saline à base de tampon phosphate (PBS), expansées dans le milieu RoosterNourish™- MSC-XF, et utilisées jusqu'au passage 6.

Des hépatocytes primaires (UpHep) achetés par Upcyte® (Hambourg, Allemagne) ont été ensemencés à une concentration de 10 000 cellules/cm2 dans des flacons de culture cellulaire T75 enduits de 0,1 mL/cm2 de 50 µg/mL de collagène de type I (Gibco) dans 20 mM d'acide acétique. Les UpHep ont été maintenues dans un milieu de haute performance et utilisées jusqu'au passage 2. Les cellules HepG2 ont été maintenues dans du milieu Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM, Euroclone, Pero, MI, Italie), supplémenté avec 10% de sérum bovin fœtal (FBS) et 2 nM de L-Glutamine (tous deux de Euroclone, Pero, MI, Italie). La lignée de CSH humaines LX-2 [28] (Sigma Aldrich, St. Louis, MO, USA) a été cultivée dans du DMEM à haute teneur en glucose (4,5 g/L, Euroclone) contenant 2% de sérum de veau fœtal et 2 nM de L-Glutamine et a été utilisée jusqu'au passage 6.

    2.2.  Isolation de l'EV :  

Pour la collecte des EV, les BM-MSC et les UC-MSC ont été ensemencées à des densités de 3000 cellules/cm2 et 2000 cellules/cm2, respectivement, dans des flacons de culture cellulaire T75 recouverts de vitronectine. Lorsque 70-80 % de confluence ont été atteints, les cellules ont été lavées avec une solution saline stérile et cultivées dans un milieu RoosterCollect™-EV chimiquement défini pendant 24 h. Par la suite, le surnageant cellulaire a été recueilli, centrifugé à 3000*g pendant 15 min à 4 ◦C, et microfiltré avec des filtres de 0,22 µm. Après élimination des débris cellulaires et des corps apoptotiques, le milieu filtré a été transféré dans des bouteilles de centrifugation en polycarbonate (Beckman Instruments, Brea, CA, USA), puis ultracentrifugé à 100 000*g pendant 2 h à 4 ◦C (Beckman Coulter Optima L-100K). Les EVs résultants ont été dilués dans du PBS et soumis à une autre série d'ultracentrifugation à 100 000*g pendant 2 h à 4 ◦C pour réduire les contaminants protéiques. Le culot final des VE a été remis en suspension dans du PBS contenant 1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO, Sigma Aldrich) et conservé à -80 ◦C jusqu'à son utilisation dans des expériences ultérieures.

L'appareil NanoSight NS300 (NanoSight Ltd., Amesbury, UK) a été utilisé pour évaluer la concentration et la distribution de taille des VE dans des conditions de flux constant (débit = 30). Pour chaque échantillon d'EV, trois vidéos de 60 s ont été enregistrées et les données ont été traitées à l'aide du logiciel Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) 3.2.

La caractérisation du phénotype des VE a été réalisée par analyse cytofluorimétrique, en suivant les protocoles précédemment établis [19,29,30]. À l'aide du kit MACSPlex Exosome humain (Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Allemagne), environ 1*109 VE provenant de trois lots, chacun de BM-MSC-EVs et UC-MSC-EVs, ont été examinés. Après incubation avec les billes de capture d'exosomes MACSPlex et contre-coloration avec des anticorps antitétraspanines conjugués à l'APC, les échantillons d'EV ont été analysés à l'aide d'un Cytoflex (Beckman Coulter). L'intensité médiane de fluorescence (MFI) de chaque sous-ensemble de billes de capture a été déterminée à l'aide du logiciel CytExpert (version 2.0, Beckman Coulter). Pour ce faire, on a soustrait l'IFM d'un témoin vierge (intensité de fluorescence de fond) de l'IFM de l'ensemble des 39 sous-ensembles de billes de capture. L'IFM résultant a ensuite été normalisé sur la base de l'IFM moyen des marqueurs exosomaux CD63, CD81 et CD9.

La taille et l'intégrité des EVs ont été évaluées par microscopie électronique à transmission. Environ 3*109 EVs ont été déposés sur des grilles de 200 mesh recouvertes de carbone nickel formvar (Electron Microscopy Science, Hatfield, PA, USA) et ont été autorisés à adhérer pendant 20 min, selon des protocoles précédemment établis [31]. Ensuite, les grilles ont été lavées avec du PBS avant d'être incubées avec une solution de glutaraldéhyde à 2,5 % contenant 2 % de saccharose, suivie d'un rinçage complet avec de l'eau distillée. Enfin, les EVs ont été soumis à une coloration négative en utilisant NanoVan (Nanoprobes, Yaphank, NY, USA) et examinés avec un microscope électronique Jeol JEM 1400 Flash (Jeol, Tokyo, Japon).

    2.3  Activation des cellules stellaires hépatiques :  

Les cellules LX-2 ont été synchronisées dans un milieu privé de sérum contenant 0,2 % d'albumine sérique bovine (Sigma Aldrich) pendant 6 h, puis ensemencées à une densité de 13 000 cellules/cm2. Pour induire l'activation, les cellules LX-2 ont été traitées avec du TGF-β1 (Sigma-Aldrich, 10 ng/mL) pendant 6 h. Ensuite, les cellules LX-2 activées ont été exposées à 50 000 EVs par cellule pendant 24 h, puis lysées pour l'extraction de l'ARN.

    2.4.    Génération de sphéroïdes hépatiques :  

Pour établir des sphéroïdes hépatiques, nous avons utilisé Sphericalplate 5D® (Kugelmeiers, Erlenbach, Suisse), une plaque de 24 puits avec des puits spécialement conçus pour contenir jusqu'à 750 sphéroïdes chacun. Un ml/puits de milieu a été utilisé pour éliminer les bulles d'air de la plaque avant l'ensemencement. Pour générer les sphéroïdes d'UpHep ou d'HepG2, 150 cellules/µwell ont été ensemencées en présence de TGF-β1 (10 ng/mL), avec un volume final total de 2 ml de milieu complet par puits. Pour générer des sphéroïdes constitués d'une co-culture de cellules UpHep ou HepG2 et LX-2, les cellules ont été mélangées dans un rapport de 10 : 1 avant d'être ensemencées en présence de TGF-β1. Pour les expériences de configuration, les sphéroïdes ont été prélevés les jours 1, 2, 3 et 6 après l'ensemencement. Dans les expériences sélectionnées, les sphéroïdes ont été autorisés à se déposer et à se former pendant 24 et 48 heures avant la stimulation EV. Deux doses de BM-MSC-EVs et UC-MSC-EVs ont été testées : 2 *108 EVs/puits (EV1 ; 2000 EVs/cellule) et 1*109 EVs/puits (EV2 ; 8000 EVs/cellule). Les sphéroïdes ont été incubés avec les EVs jusqu'au 6ème jour après l'ensemencement, puis lavés avec du PBS et lysés pour l'extraction de l'ARN.

    2.5.  Analyse moléculaire :  

L'ARN a été isolé des cellules à l'aide du mini kit miRNeasy (Qiagen, Valencia, CA, USA) et converti en ADNc, comme décrit [21]. Le système QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR à 96 puits (Thermo Fisher Scientific) a été utilisé pour la réaction en chaîne de la polymérase quantitative en temps réel (RT-PCR), réalisée comme indiqué précédemment [21]. Les amorces oligonucléotidiques spécifiques de la séquence (100 nM, fournies par MWG-Biotech, Eurofins Scientific, Bruxelles, Belgique) sont énumérées dans le tableau 1. Les changements relatifs du niveau d'expression des gènes ont été déterminés à l'aide de la méthode ∆∆Ct, le TBP étant le gène de référence.

Tableau 1. Amorces utilisées pour la RT-PCR.

Gène	Séquence d'amorçage avant	Séquence de l'amorce inverse
ACTA2 ALB COL1A1 CYP1A1 CYP3A4 TBP TGFB1	TGGCTATTCCTTCGTTACTACTGCT TTATGCCCCGGAACTCCTTT CAAGAGGAAGGCCAAGTCGAG GGGCGTTCTGTCTTTGTAA AATCTGTGCCTGAGAACACCAGA TGTGCACAGGAGCCAAGAGT GACTACTACGCCAAGGAGGT	CTCATTTTCAAAGTCCAGAGCTACAT ACAGGCAGGCAGCTTTATCAG TTGTCGCAGACGCAGATCC TGGGTTGACCCATAGCTTCT AGTCCATTGGATGAAGCCCA ATTTTCTTGCTGCCAGTCTGG GGAGCTCTGATGTGTTGAAG

 

    2.6.  Western Blot  

Pour l'analyse des protéines, les cellules et les EV ont été lysées sur de la glace, à l'aide du tampon de lyse 17 contenant 10 µg/mL d'aprotinine, 10 µg/mL de leupeptine et 10 µg/mL de pepstatine (tous achetés auprès de R&D Systems, Minneapolis, Minnesota, États-Unis), en suivant les instructions du fabricant. La concentration en protéines a été quantifiée à l'aide du kit de dosage des protéines BCA (Pierce™ Thermo Fisher Scientific). Les protéines ont été séparées par électrophorèse dans des gels de polyacrylamide à 4-20% et transférées sur des membranes de nitrocellulose, comme décrit précédemment . Le blocage des membranes a été effectué dans du Clear Milk Blocking Buffer (Pierce™ Thermo Fisher) pendant 2 h à température ambiante, suivi d'une nuit d'incubation à 4 ◦C avec des anticorps primaires, tous achetés à Cell Signaling Technologies (Danvers, MA, USA) et listés dans le tableau 2. Après une incubation de 1 h avec les anticorps secondaires appropriés conjugués à la peroxydase (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific), les signaux chimiluminescents ont été développés à l'aide du substrat SuperSignal™ West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Thermo Fisher Scientific) et visualisés à l'aide de l'instrument Chemidoc (Bio-Rad, Hercules, CA, USA).
Table 2. Anticorps utilisés pour la détection des protéines.

Anticorps	Code	Source
Anti-Alix primaire Primaire anti-CD9 Primaire anti-CD63 Primaire anti-CD81 Primaire anti-GM130 Primaire anti-TSG101 Anti-souris secondaire Anti-lapin secondaire	CST#2171 CST#13174 CST#52090 CST#56039 CST#12480 CST#72312 Invitrogen #31430 Invitrogen #31462	souris lapin lapin lapin lapin lapin chèvre chèvre

 

    2.7.  Immunocoloration :  

Six jours après l'ensemencement, les sphéroïdes ont été récoltés dans la Sphericalplate 5D® et ensemencés dans des lames de chambre (Corning, Glendale, AZ, USA) pendant la nuit. Le jour suivant, les sphéroïdes ont été rincés avec du PBS et fixés avec du paraformaldéhyde à 2% pendant 30 min à 4 ◦C. Après une étape de blocage de 30 min dans du PBS contenant 5% d'albumine de sérum bovin (Sigma Aldrich), les sphéroïdes ont été incubés pendant 1 h avec un anticorps primaire ciblant le collagène I alpha 1 (Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA). Après un lavage au PBS, les sphéroïdes ont été incubés pendant 1 h à température ambiante avec un anticorps secondaire conjugué à l'Alexa Fluor 488 (Molecular Probes, Invitrogen, Eugene, OR, USA). Les sphéroïdes colorés uniquement avec l'anticorps secondaire ont servi de contrôle. Le colorant Hoechst 33258 (Sigma Aldrich) a été utilisé pour la coloration des noyaux. L'analyse par microscopie à fluorescence a été réalisée à l'aide d'un microscope Zeiss Apotome (Carl Zeiss International, Jena, Allemagne).

    2.8.  Analyses statistiques :  

GraphPad Prism v.8.0 a été utilisé pour l'analyse des données. Les résultats ont été présentés sous forme de moyenne ± écart-type (ET). La signification statistique a été déterminée à l'aide de l'ANOVA suivie du test de comparaisons multiples de Dunnett, une valeur p de <0,05 étant considérée comme significative.

3.  Results :  

    3.1.  Formation de sphéroïdes hépatiques à l'aide de HepG2 et LX-2 :  

Les sphéroïdes hépatiques ont été générés par la co-culture d'une lignée cellulaire de substitution hépatocytaire (HepG2) avec des CSH humaines (LX-2) dans un rapport 10:1 à l'intérieur d'une Sphericalplate 5D® (Figure 1A). Ce système de culture particulier a facilité la formation rapide de sphéroïdes hépatiques. Comme contrôle, nous avons mis en place des sphéroïdes hépatiques formés uniquement à partir de cellules HepG2. Dans les deux modèles, les cellules hépatiques ont commencé à s'agréger dans les 24 heures suivant l'ensemencement et ont maintenu leurs structures sphéroïdes 3D jusqu'au sixième jour après l'ensemencement. Pendant cette période, à part une légère augmentation de la taille des sphéroïdes, aucun changement morphologique n'a été observé (Figure 1B).

Comme indiqué dans le flux de travail (Figure 1A), nous avons induit une fibrose en exposant des sphéroïdes hépatiques formés par la co-culture de HepG2 et LX-2 ou HepG2 au TGF-β1. Les changements morphologiques et moléculaires ont ensuite été évalués jusqu'au sixième jour de culture, et seulement dans les sphéroïdes formés par la co-culture, une croissance réduite a été observée après l'exposition au TGF-β1 (Figure 1B). Dans les sphéroïdes formés par HepG2 et LX-2, le traitement au TGF-β1 a entraîné une augmentation de l'expression des marqueurs fibrotiques COL1A1 et TGF-β1, alors qu'aucune différence significative dans l'expression de l'α-SMA n'a été observée (Figure 1C). Il est intéressant de noter que les sphéroïdes formés exclusivement par HepG2 n'exprimaient pas COL1A1 en soi, et que la stimulation par le TGF-β1 a augmenté les niveaux d'expression du TGF-β1 sans affecter l'expression de COL1A1 (Figure 1C). En outre, l'analyse par immunofluorescence au moyen de la microscopie confocale a confirmé l'augmentation de l'expression du collagène I induite par le TGF-β1 dans les sphéroïdes en coculture (Figure S1A). Ces résultats suggèrent que le TGF-β1 peut induire un phénotype fibrotique dans les sphéroïdes hépatiques générés par la co-culture de HepG2 et de LX-2.

Figure 1. Cont

Figure 1. Montage de sphéroïdes hépatiques utilisant HepG2 et LX-2. (A) Diagramme illustrant le montage expérimental réalisé in vitro pour générer des sphéroïdes hépatiques en utilisant la co-culture de HepG2 et LX-2 ou HepG2 uniquement ; créé avec BioRender.com. (B) Observation morphologique au microscope optique des sphéroïdes hépatiques du jour 1 au jour 6 après l'ensemencement des cellules (barre d'échelle, 100 µm). (C) Analyse quantitative par RT-PCR de l'expression des gènes profibrotiques dans les sphéroïdes hépatiques jusqu'à 6 jours après l'ensemencement. Les niveaux d'expression ont été normalisés par rapport au gène de référence TBP. Les sphéroïdes hépatiques HepG2 et LX-2 non activés par le TGF-β1 ont servi de contrôle de référence. Les données provenant d'au moins trois expériences indépendantes ont été analysées à l'aide d'un test ANOVA à deux voies : * p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001 ; et **** p < 0,0001.

    3.2.    Formation de sphéroïdes hépatiques à l'aide d'UpHep et de LX-2 :  

Un modèle 3D utilisant des hépatocytes primaires a également été mis en place. Comme le montre la figure S2A, dans la culture 2D, UpHep présente une morphologie hétérogène, avec des cellules polygonales et fusiformes. Cette population mixte pourrait inclure non seulement des hépatocytes matures mais aussi d'autres cellules hépatiques, qui ont une morphologie de type fibroblaste et expriment COL1A1 et α-SMA au niveau de l'ARNm, ce qui ressemble aux caractéristiques des CSH (Figure S2B). De plus, par rapport à la culture en 2D, les UpHep cultivées en sphéroïdes ont montré une expression réduite des gènes associés à la fibrose (Figure S2B). Ce résultat suggère que la culture 3D permet à la population de CSH au sein des UpHep de maintenir un état quiescent. En revanche, la culture en 2D tend à favoriser l'activation des CSH, comme le montre l'expression plus élevée de COL1A1 et d'α-SMA. Notamment, par rapport à la culture 2D, les UpHep cultivés en sphéroïdes ont montré une augmentation significative de l'expression du marqueur hépatocytaire CYP1A1 dès le premier jour de la culture 3D (Figure S2C). En outre, l'expression des marqueurs hépatocytaires albumine et CYP3A4 a augmenté de manière significative dans les sphéroïdes UpHep à partir du deuxième jour de culture (Figure S2C). Ces données indiquent qu'une culture en 3D peut promouvoir la différenciation des hépatocytes plus efficacement qu'une culture en 2D.

Nous avons généré des sphéroïdes hépatiques dans une Sphericalplate 5D® en faisant co-cultiver UpHep avec des cellules LX-2 dans un rapport de 10:1 (Figure 2A). Comme contrôle, des sphéroïdes hépatiques composés uniquement d'UpHep ont également été préparés. Comme pour le modèle 3D précédent, les cellules hépatiques ont commencé à s'agréger dans les 24 heures suivant l'ensemencement et ont conservé leur apparence de sphéroïde 3D jusqu'au sixième jour après l'ensemencement. Aucun changement morphologique significatif n'a été observé au cours de cette période dans les sphéroïdes (Figure 2B).

Figure 2. Cont.

Figure 2. Montage de sphéroïdes hépatiques utilisant UpHep et LX-2. (A) Diagramme illustrant le montage expérimental réalisé in vitro pour générer des sphéroïdes hépatiques en utilisant la co-culture d'UpHep et de LX-2 ou UpHep uniquement ; créé avec BioRender.com. (B) Observation morphologique au microscope optique des sphéroïdes hépatiques du jour 1 au jour 6 après l'ensemencement des cellules (barre d'échelle, 100 µm). (C,D) Analyse quantitative par RT- PCR évaluant l'expression des gènes profibrotiques (C) et spécifiques des hépatocytes (D) dans les sphéroïdes hépatiques jusqu'à 6 jours après l'ensemencement. Les niveaux d'expression ont été normalisés par rapport au gène de référence TBP. Les sphéroïdes hépatiques d'UpHep non activés par le TGF-β1 ont servi de contrôle de référence. Les données provenant d'au moins trois expériences indépendantes ont été analysées à l'aide d'un test ANOVA à deux voies : * p < 0,05 ; ** p < 0,01;*** p < 0,001 ; et **** p < 0,0001.

Pour induire une fibrose dans les sphéroïdes hépatiques, les cellules hépatiques ont été ensemencées en présence de TGF-β1 (Figure 2A). Les changements morphologiques et moléculaires ont été évalués jusqu'au sixième jour de culture, et aucune modification significative de la croissance n'a été observée après l'exposition au TGF-β1 (Figure 2B). Le traitement au TGF-β1 a entraîné une augmentation de l'expression des marqueurs fibrotiques COL1A1 et TGF-β1 au niveau de l'ARNm (Figure 2C). L'analyse par immunofluorescence des sphéroïdes formés par UpHep a confirmé une augmentation de l'expression du collagène I induite par le TGF-β1 (Figure S1B). Notamment, la stimulation par le TGF-β1 a augmenté les niveaux d'expression de l'αSMA exclusivement dans les sphéroïdes formés par UpHep, ce qui suggère que les CSH pourraient être présentes dans UpHep et acquérir un phénotype activé lors de l'exposition au TGF-β1 (Figure 2C).

En outre, l'expression de l'albumine et d'autres enzymes spécifiques des hépatocytes (CYP1A1 et CYP3A4) dans les sphéroïdes hépatiques a été significativement réprimée par la stimulation du TGF-β1 (Figure 2D). Dans l'ensemble, ces résultats indiquent que le TGF-β1 peut induire un phénotype fibrotique dans les sphéroïdes hépatiques avec une altération de la fonction hépatique, en particulier dans les sphéroïdes générés exclusivement par UpHep, que nous avons décidé d'utiliser dans les expériences ultérieures.
     3.3.    Caractérisation des VE :  

Les VE dérivées des BM-MSC et des UC-MSC ont été caractérisées conformément aux directives de l'ISEV [32]. Une analyse NTA a révélé une taille moyenne des EV comparable à celle des exosomes et des microvésicules, tandis qu'une analyse TEM a confirmé que les préparations d'EV contenaient des particules intactes de taille nanométrique avec des membranes doubles (Figure 3A,B).

Une analyse cytométrique en flux (Figure 3C,D) et une analyse par Western blot (Figure 3E) ont démontré que les EVs exprimaient les marqueurs exosomaux typiques ALIX, TSG101, CD9, CD63 et CD81. L'origine mésenchymateuse des EV a été validée par la présence des molécules de surface CD29, CD44, CD105 et CD146, qui sont caractéristiques des MSC. En outre, l'expression des marqueurs de cellules souches MCSP et SSEA-4 était plus élevée dans les EVs UC-MSC que dans les EVs BM-MSC. Les deux populations d'EV ne présentaient aucune expression des marqueurs épithéliaux Ep- CAM/CD326 et CD24, des marqueurs hématopoïétiques (CD45) et endothéliaux (CD31), ou des antigènes leucocytaires humains (HLA) de classe I et II (Figure 3C,D).

 

Figure 3. Caractérisation des VE de BM-MSC et des VE de UC-MSC. (A,B) Graphiques représentatifs illustrant la distribution de la taille des VE par l'analyse de suivi des nanoparticules (les lignes rouges indiquent la moyenne des trois vidéos enregistrées), ainsi que des micrographies de microscopie électronique à transmission montrant des VE de CSM-BM intactes (A) et des VE de CSM-UC (B). Les EV ont subi une coloration négative à l'aide de NanoVan (barre d'échelle, 200 nm). (C,D) Les profils moléculaires de surface des BM-MSC-EVs (C) et des UC-MSC-EVs (D) ont été évalués par cytométrie de flux multiplex à base de billes. Les marqueurs exosomaux et les marqueurs mésenchymateux sont indiqués par des barres noires et des barres bleu clair, respectivement. Les deux graphiques présentent une quantification des valeurs médianes de fluorescence APC pour 39 populations de billes différentes après correction du bruit de fond. Notamment, aucune variance statistiquement significative n'a été détectée entre les trois préparations distinctes de BM-MSC-EVs et UC-MSC-EVs. (E) Analyse représentative par Western blot montrant la présence de marqueurs exosomaux dans les EVs. Le marqueur cis-Golgi GM130, absent dans les EVs mais exprimé dans les cellules, a servi de contrôle négatif.

    3.4.  Les EVs atténuent la fibrose dans les sphéroïdes hépatiques :  

Nous avons évalué l'effet des VE sur les sphéroïdes hépatiques composés de cellules HepG2 et LX-2 et sur les sphéroïdes hépatiques formés par UpHep. Dans les deux modèles 3D, les sphéroïdes hépatiques ont été traités avec deux doses différentes de VE (EV1 =2*108 VE/puits et EV2 = 1*109 VE/puits) provenant de BM-MSC et d'UC-MSC à 24 h et 48 h après l'ensemencement. Par la suite, les sphéroïdes ont été analysés au sixième jour de culture (Figure 4A). L'administration de VE n'a pas eu d'effets perceptibles sur l'état de croissance des sphéroïdes hépatiques traités au TGF-β1 (Figure S3A). Au niveau de l'ARN, le traitement avec la dose la plus élevée de VE de BM-MSC et UC-MSC a permis d'atténuer l'expression de COL1A1 et de TGF-β1 dans les sphéroïdes HepG2 et LX-2 (Figure 4B) et de réduire l'expression d'αSMA dans les sphéroïdes UpHep (Figure 4C). La régulation à la baisse du collagène I et de l'αSMA a également été observée au niveau des protéines dans les sphéroïdes HepG2 et LX-2 (Figure 4D) et dans les sphéroïdes UpHep (Figure 4E). Ces résultats suggèrent que les EVs, aux doses testées, sont capables d'atténuer le phénotype fibrotique induit par le TGF-β1 dans les sphéroïdes de foie. Enfin, le traitement par les VE n'a pas modifié de manière significative l'expression de l'albumine et des enzymes hépatiques dans les sphéroïdes d'hépatocytes primaires traités par le TGF-β1 (Figure S3B).

Figure 4. Effet antifibrotique des VE sur des sphéroïdes hépatiques traités au TGF-β1 (A) Diagramme illustrant le montage expérimental réalisé in vitro pour évaluer l'impact des VE dérivées des CSM-BM et des CSM-UC sur des sphéroïdes générés à l'aide de HepG2 et LX-2 ou UpHep uniquement ; créé avec BioRender.com. (B,C) Analyse quantitative par RT-PCR évaluant l'expression des gènes profibrotiques dans les sphéroïdes générés à l'aide de HepG2 et LX-2 (B) ou UpHep uniquement (C) après stimulation avec des EVs obtenues à partir de BM-MSCs et UC-MSCs. Les niveaux d'expression ont été normalisés par rapport au gène de référence TBP. (D,E) Quantification des bandes de protéines et images représentatives de l'analyse Western blot montrant les marqueurs profibrotiques dans les sphéroïdes formés par HepG2 et LX-2 (D) ou UpHep uniquement (E). Les intensités des bandes de protéines ont été normalisées par rapport à l'expression de la vinculine. Les contrôles de référence de toutes les expériences étaient constitués de sphéroïdes hépatiques activés par le TGF-β1 (10 ng/mL) mais non traités par les VE. Le contrôle négatif (CTR) était constitué de sphéroïdes hépatiques cultivés en l'absence de TGF-β1. Les données provenant d'au moins trois expériences indépendantes ont été analysées à l'aide d'un test ANOVA à deux voies : * p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; *** p < 0,001 ; et **** p < 0,0001.

    3.5.   Les EV atténuent le phénotype activé des CSH :

Pour examiner comment les VE affectent l'état activé des CSH, les cellules LX-2 activées par le TGF- β1 ont été traitées avec des VE obtenues à partir de CSM-BM ou de CSM-UC, selon la procédure décrite dans la figure 5A. L'activation des cellules LX-2 par le TGF-β1 a entraîné une augmentation de l'expression de deux gènes associés à la fibrose, α-SMA et COL1A1. Cependant, après incubation des cellules LX-2 avec des VE de BM-MSC et de UC-MSC pendant 24 heures, une diminution significative des niveaux d'expression d'α-SMA et de COL1A1 a été observée (Figure 5B).

Figure 5 : Effet antifibrotique des VE sur le LX-2 activé par le TGF-β1. Effet antifibrotique des VE sur les cellules LX-2 activées par le TGF-β1. (A) Diagramme illustrant le montage expérimental réalisé in vitro pour évaluer l'impact des VE dérivées des CSM-BM et des CSM-UC sur les cellules LX-2 ; créé à l'aide de BioRender.com. (B) Analyse quantitative par RT-PCR de l'expression des gènes profibrotiques dans les cellules LX-2 après une période d'incubation de 24 heures avec des VE obtenues à partir de CSM-BM et de CSM-UC. Les niveaux d'expression ont été normalisés par rapport au gène de référence TBP. Le contrôle de référence était constitué de cellules LX-2 activées par le TGF-β1 (10 ng/mL) mais non traitées avec des EVs. Le contrôle négatif (CTR) était constitué de cellules LX-2 cultivées en l'absence de TGF-β1. Les données provenant d'au moins trois expériences indépendantes ont été analysées à l'aide d'un test ANOVA à deux voies : * p < 0,05 ; ** p < 0,01 ; et **** p < 0,0001.

4.  Discussion :  

La fibrose hépatique se manifeste comme une affection chronique, progressive et irréversible caractérisée par des lésions hépatocytaires et un remodelage structurel des tissus. Alors que le foie fait généralement preuve d'une capacité de régénération en réponse à une lésion aiguë, les agressions chroniques du foie déclenchent des réponses inflammatoires et de cicatrisation soutenues, ce qui compromet sa capacité à se régénérer efficacement [33]. Les traitements anti-inflammatoires conventionnels ne parviennent souvent pas à provoquer une réponse thérapeutique aux stades avancés des lésions hépatiques chroniques. Bien que certains médicaments antifibrotiques et la thérapie par cellules souches offrent une efficacité limitée, les approches émergentes basées sur la nanomédecine sont prometteuses pour la prévention et le traitement de la fibrose hépatique [11]. Notamment, les VE dérivées de diverses sources de CSM ont démontré un potentiel thérapeutique dans des conditions fibrotiques affectant divers organes, y compris le cœur, les reins et les poumons [34]. En particulier, les VE provenant des CSM-BM [35] et des CSM-UC [36-38] ont montré des effets antifibrotiques protecteurs dans des modèles précliniques de fibrose hépatique.

Il a été démontré que les stratégies d'amorçage qui modulent l'environnement cellulaire des CSM pendant l'expansion in vitro améliorent considérablement les attributs fonctionnels des CSM et de leurs VE. Les techniques de préconditionnement, telles que le préconditionnement hypoxique, l'exposition à des cytokines pro-inflammatoires et les environnements de culture 3D, peuvent améliorer le potentiel thérapeutique des CSM-EV dans des contextes pathologiques spécifiques, tels que la fibrose hépatique [39]. Le préconditionnement hypoxique consiste à cultiver les CSM dans des conditions de faible teneur en oxygène, ce qui augmente le facteur 1-alpha inductible à l'hypoxie, entraînant la sécrétion d'EV ayant des capacités régénératives accrues [40,41]. Les MSC-EV induites par l'hypoxie sont enrichies en facteurs angiogéniques et présentent une capacité accrue à promouvoir la réparation des tissus et l'angiogénèse. L'exposition à des cytokines pro-inflammatoires, telles que le facteur de nécrose tumorale alpha et l'interféron gamma, incite les CSM à produire des VE aux propriétés anti-inflammatoires et immunomodulatrices améliorées [42,43]. En outre, les CSM cultivées dans des environnements 3D, tels que les sphéroïdes ou les systèmes à base d'échafaudages, produisent des VE ayant une activité antifibrotique supérieure à celle des cultures 2D, en raison de la sécrétion accrue de molécules bioactives [44]. L'optimisation de ces techniques d'amorçage pourrait faire progresser considérablement les thérapies par CSM-EV pour la fibrose hépatique et d'autres maladies fibrotiques.

Pour garantir la sécurité et l'efficacité des VE dans un futur contexte clinique, il est nécessaire d'éliminer toute contamination potentielle présente dans les milieux de culture. À cet égard, il est préférable de ne pas utiliser de milieux contenant du FBS ou du lysat de plaquettes humaines, qui pourraient également être une source de VE [45]. Pour éliminer les effets secondaires inconnus des VE présents dans le FBS, la déplétion des VE du FBS par ultracentrifugation et les procédures de famine sont principalement utilisées pour éliminer le FBS lors de la collecte des CSM-EV [46]. Cependant, l'utilisation de ces méthodes n'exclut pas la présence de protéines et d'autres impuretés d'origine animale présentes dans le FBS et ne prend pas en compte le rendement limité de la production de VE dans des conditions de famine. Pour surmonter ces limitations, nous avons utilisé des cellules MSC et des milieux chimiquement définis, sans substance, dérivés d'espèces non humaines pour l'isolement des VE [47,48].

Les CSM-EV exercent leurs effets antifibrotiques par le biais de plusieurs mécanismes potentiels. Les CSM-EV peuvent délivrer une variété de molécules bioactives, y compris des protéines, des lipides et des ARN, dont il a été démontré qu'elles influencent la reprogrammation cellulaire et favorisent la différenciation des hépatocytes, améliorant ainsi la régénération du foie [49]. Les CSH, qui jouent un rôle essentiel dans la fibrogenèse hépatique, sont une autre cible cellulaire des CSM-EV dans le foie [3]. L'activation des CSH est un événement clé dans la progression de la fibrose hépatique [4]. Des études antérieures ont démontré que les VE isolées des CSM dérivées de l'amnios [50] et des CSM dérivées du placenta [22] inhibent l'activation des CSH à la fois in vivo et dans des modèles in vitro 2D et 3D de fibrose hépatique. Nous avons précédemment démontré que les VE dérivées des CSH et des CSM-BM atténuaient le phénotype activé des CSH in vitro [21]. En accord avec ces résultats, notre étude a révélé que le traitement avec des VE dérivées de CSM-BM et de CSM-UC cultivées dans un milieu chimiquement défini entraînait la régulation à la baisse de l'expression des marqueurs fibrotiques dans les CSH activées.

Les progrès récents des systèmes de culture 3D ont permis d'étudier les interactions complexes entre les différents types de cellules impliquées dans la progression de la fibrose, en particulier les hépatocytes et les CSH. Les hépatocytes primaires humains sont considérés comme l'étalon-or de la recherche en hépatologie [51]. Cependant, leur application est limitée par la disponibilité restreinte du tissu hépatique, leur coût élevé, leur courte durée de vie en culture et la variabilité importante entre les différentes préparations [52]. En revanche, les lignées cellulaires présentent des avantages tels que la disponibilité, la robustesse et la reproductibilité. Les cellules HepG2, par exemple, sont largement utilisées dans les études d'hépatotoxicité, mais elles sont incapables de détecter l'hépatotoxicité médiée par le métabolisme en raison de l'absence d'enzymes cytochromes P450 [53]. Récemment, la technologie Upcyte a permis de créer des hépatocytes humains capables de proliférer tout en conservant certaines fonctions différenciées [54].

Dans notre étude, nous avons établi deux sphéroïdes 3D de foie différents, incorporant la lignée cellulaire de substitution des hépatocytes (HepG2) et les CSH, ou UpHep. Dans les deux modèles 3D, nous avons observé que les sphéroïdes de foie s'auto-assemblaient 24 heures après l'ensemencement et conservaient leur intégrité structurelle jusqu'à 6 jours après l'ensemencement. Le traitement au TGF-β1 a entraîné la régulation à la hausse des marqueurs fibrotiques dans les sphéroïdes formés par les cellules HepG2 et LX-2 et dans les sphéroïdes générés par UpHep, ce qui indique une transition d'un phénotype normal à un phénotype fibrotique.

La morphologie d'UpHep a montré une hétérogénéité significative, indiquant une population mixte qui comprend non seulement des hépatocytes matures mais aussi d'autres cellules hépatiques ayant une forme de fibroblaste. De plus, l'expression accrue de gènes profibrotiques dans les sphéroïdes UpHep lors de la stimulation par le TGF-β1 suggère qu'UpHep n'est pas une culture pure d'hépatocytes primaires et qu'elle peut contenir des CSH. Par conséquent, il n'est pas nécessaire d'ajouter des cellules LX-2 aux sphéroïdes UpHep, car elles peuvent être intrinsèquement présentes dans la culture. En revanche, la stimulation par le TGF-β1 des sphéroïdes formés par HepG2 n'entraîne pas de phénotype profibrotique, ce qui rend l'ajout de cellules LX-2 essentiel.

Ensuite, nous avons testé l'impact des EVs dérivées des BM-MSCs et des UC-MSCs sur des sphéroïdes hépatiques contenant des cellules HepG2 et LX-2, ainsi que sur celles formées par UpHep. Nos observations ont révélé que les VE isolées des deux types de CSM supprimaient l'expression des marqueurs fibrotiques induits par le TGF-β1. Ces résultats suggèrent que les VE dérivées des CSM ont un potentiel significatif pour atténuer la fibrose, en accord avec une étude précédente qui a rapporté la capacité des VE obtenues par les CSM placentaires à supprimer l'expression des marqueurs fibrotiques induite par le TGF-β1 dans les organoïdes du foie [22]. Les paramètres expérimentaux 3D corroborent les études in vivo qui ont montré l'utilisation thérapeutique des CSM-EV comme traitement prometteur des maladies chroniques du foie [55].

5.  Conclusions :  

En résumé, l'administration d'EVs dérivées de BM-MSCs et UC-MSCs a démontré des effets antifibrotiques dans les sphéroïdes de foie. Ces effets thérapeutiques sont probablement attribués à l'inactivation des CSH, comme en témoigne la réduction de la production de collagène et de l'expression de l'αSMA. Par conséquent, cette thérapie acellulaire se présente comme une alternative prometteuse pour le traitement des maladies chroniques du foie. En outre, le modèle de sphéroïde fibrotique hépatique induit par le TGF-β1 pourrait constituer un outil précieux pour le dépistage de médicaments antifibrosants.

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